細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體檢測(cè)方法如約而至

第三期來(lái)啦！

還沒(méi)有看前兩期內(nèi)容的小伙伴

可以看我之前發(fā)的：支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（一）、支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（二）

上回書(shū)和上上回書(shū)說(shuō)道

qPCR檢測(cè)法是一種目前比較常用

效果也比較可靠的方法

那除了qPCR

還有沒(méi)有其他方法可以檢測(cè)呢？

所以今天就來(lái)講講

分離培養(yǎng)法和DNA染色法

有請(qǐng)兩位主角閃亮登場(chǎng)

01、分離培養(yǎng)法

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，這種方法的基本原理就是：分離，然后培養(yǎng)

聽(tīng)君一席話(huà)如聽(tīng)一席話(huà)，展開(kāi)來(lái)講，就是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，接種到適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上快速生長(zhǎng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。

操作規(guī)范的情況下，這種方法很少會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。

缺點(diǎn)就是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。另一方面，盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類(lèi)，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. Hyorhinis。因此，該方法能鑒定的支原體種類(lèi)有限，成為它的另一個(gè)缺點(diǎn)。

02、DNA染色法

該方法的實(shí)驗(yàn)思路是：培養(yǎng)指示細(xì)胞、樣品上清液收集、上清液接種、染色觀察結(jié)果

這一波操作看起來(lái)有點(diǎn)復(fù)雜，那展開(kāi)說(shuō)說(shuō)：

將供試品接種于指示細(xì)胞（無(wú)污染的Vero 細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞，供試品應(yīng)對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。下面以Vero細(xì)胞為例）中培養(yǎng)后，用特異熒光染料（如Hoechst 33258）染色，支原體中的核酸也可以被著色，因此，如果待檢測(cè)細(xì)胞中含有支原體，那么就會(huì)導(dǎo)致指示細(xì)胞被感染，進(jìn)而在細(xì)胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍(lán)色熒光（支原體附著在細(xì)胞膜上，也有可能游離在細(xì)胞培養(yǎng)基中）。

指示細(xì)胞培養(yǎng)：將指示細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，調(diào)整至最佳狀態(tài)，留出適宜的量備用。

樣品上清液收集：無(wú)抗生素培養(yǎng)基中加入待檢測(cè)樣品后，細(xì)胞需至少傳一代，然后取細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)且3 天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢。（為了對(duì)待檢測(cè)樣品中的支原體進(jìn)行富集）

上清液接種：在制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入一定量的待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，36°C培養(yǎng)3-5 天。指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1 次，末次傳代培養(yǎng)可用6孔板培養(yǎng)3-5 天。

染色觀察：吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入固定液，放置5分鐘。吸出固定液后進(jìn)行10min的二次固定，再次吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，漂洗3次，干燥，封片。用熒光顯微鏡觀察。

熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面或培養(yǎng)基中，有大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光著色顆粒，則說(shuō)明有可能存在支原體污染。

對(duì)于DNA染色法方法，優(yōu)缺點(diǎn)也是很明顯的：

優(yōu)點(diǎn)：

1、適用于一些不易培養(yǎng)的支原體，如豬鼻支原體，分離培養(yǎng)法對(duì)該支原體檢測(cè)并不可靠，但可用DNA染色法準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。

2、操作步驟雖然多，但都相對(duì)簡(jiǎn)單

3、靈敏度尚可。

缺點(diǎn)：

1、時(shí)間較長(zhǎng)，從Vero細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，再到收集上清后再次培養(yǎng)，有時(shí)甚至需要十幾天時(shí)間

2、存在假陽(yáng)性和假陰性的可能：如一些死亡細(xì)胞釋放出來(lái)的DNA會(huì)被染成藍(lán)色，出現(xiàn)假陽(yáng)性；或是由于熒光過(guò)若而出現(xiàn)假陰性使結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗(yàn)。